如何辅助ADC研发“精准制导”
2021-12-28 00:00 医麦客
2021年12月27日/医麦客新闻 eMedClub News/--近年来，抗体药物偶联物（Antibody-Drug Conjugates，ADC）已在全球掀起研发浪潮，ADC具有靶向性强，毒副作用小等优点，可精准打击癌细胞，在肿瘤治疗领域具有广阔的应用前景。Nature Reviews Drug Discovery 预计全球已上市 ADC 药物的市场规模到 2026 年将超过 164亿美元，
对于ADC，抗体的内化是一种强有力的作用机制，可以使ADC从靶细胞质膜上的结合位点转移至溶酶体内，从而激活并释放与其相连的毒性药物，最终杀死癌细胞。
抗体内化过程的效率与ADC的治疗指数直接相关。Invitrogen™ Molecular Probes™ 荧光标记和检测试剂以其在荧光标记领域的领先地位，整合了强大的pHrodo™ iFL技术、Zenon™标记技术和SiteClick™抗体标记技术，提供便捷高效且易于使用的抗体内化检测工具。
ADC内化过程会依次进入内涵体和溶酶体，周围pH逐渐酸化降低。pHrodo iFL是一种pH敏感的染料，在中性条件下无荧光信号，内化后在酸性pH环境下可发出强烈的荧光，并且可随pH值的减少而增强，因此对物质的细胞内吞清晰可见，能够便捷直观地在标记抗体后检测内化水平。
图1. 使用氨基反应性Invitrogen™ pHrodo™ iFL Red和pHrodo™ iFL Green制备的赫赛汀结合物的pH应答图谱。这些结合物在细胞外的中性pH下几乎无荧光，一旦内化进入细胞后可发出明亮的荧光。
图2.使用氨基反应性pHrodo™ iFL Red STP ester制备的赫赛汀结合物仅在内化至酸性细胞器内才发出荧光。使用Invitrogen™ CellLight™ Lysosomes-GFP和NucBlue™ Live ReadyProbes™试剂标记Her2+的SK-BR-3细胞，加入pHrodo™ iFL Red–赫赛汀处理18小时，在Invitrogen™ EVOS™ FL Auto成像系统上成像。SiteClick™ 抗体标记技术可以位点特异性地将荧光染料、小分子药物、生物素等连接至IgG抗体重链的N 糖基化位点上，远离抗原结合域，实现高重复性的标记。
图3. SiteClick标记步骤为使用酶修饰，然后通过点击化学反应连接标记物。SiteClick抗体标记过程的第一步是使用ß-半乳糖苷酶去除重链N-连接聚糖上的末端半乳糖残基，暴露可修饰的GlcNAc残基。第二步，使用GalT(Y289L)酶通过酶促反应将GalNAz连接至末端GlcNAc残基上，利用叠氮标签活化游离的末端GlcNAc残基。第三步，利用点击化学反应使叠氮残基与所选择的二苯环辛炔(sDIBO)-功能化探针(如Alexa Fluor 488 sDIBO炔烃)反应。
图4. SiteClick可实现高效、均匀且可重复的标记。28种不同抗体的DOL变异性 < 10% 。Zenon™ 标记技术提供了一种可靠的方法，结合pHrodo 染料可特异性靶向人或小鼠IgG抗体的Fc片段，并在10分钟内生成Zenon荧光标记抗体。该方法十分灵活，可用于筛选不同的抗体或不同抗体浓度，实现简便的规模化抗体内化筛选。
图5. 使用Zenon pHrodo iFL Red试剂标记的Rituximab被内化至CD20+细胞后可发出明亮的荧光，清晰指示了宽抗体浓度范围内的特异性抗体内化。使用三种不同浓度的Zenon pHrodo iFL Red试剂标记后，将不同浓度的Rituximab标记物加入CD20+细胞中，37°C孵育16小时，使用Attune NxT流式细胞仪检测信噪比。
图6. Zenon pHrodo iFL 试剂对所有IgG亚型都具有高亲和性，可特异性标记人IgG Fc段。 热销赛默飞抗体内化检测试剂
